Pubblicazioni
3th National Italian Virological Medical Society Congress.
3th National Italian Virological Medical Society Congress, Rome May 6-8, 2008.
S. Rolla[1], S. Racca[1], E lavanga[1], D. Carcione[1], C. Lauterio, A.[2] ,De Montis[2], M. Clementi[1][3]
La diagnosi d’infezione da papilloma virus umani (HPV) si basa oggi sul rilevamento di DNA virale in campioni biologici e i risultati di ricerca e tipizzazione di HPV DNA hanno un notevole valore predittivo clinico-oncologico. Il presente studio è stato finalizzato alla valutazione di un novo sistema molecolare commerciale basato sull’uso di un microarray progettato per la rivelazione di sequenze di HPV amplificate mediante multiplexer PCR (bcs Biotech S.P.A. Cagliari, Italia). Le sequenze, riferibili alla regione L1 e alla regione E6/E7 di tipi di HPV ad alto e basso rischio, sono state selezionate al fine di poter identificare il genotipo virale ed escludere la presenza di falsi negativi dovuti alla possibile integrazione del DNA virale. In particolare, il microarray è stato disegnato in modo da disporre di sonde (deposte su un supporto plastico) che riconoscono 24 diversi bersagli genici: le regioni L1 di 19 tipi di HPV [14 ad alto-medio rischio (16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,68,73) e 5 a basso rischio (6,11,42,43,44)], le regioni E6/D7 dei principali tipi ad alto-medio rischio (16,30,51,53,56,66,82) e, infine, una sequenza (circa 170bp) di beta-globina umana. Una ulteriore sonda è inserita come controllo di ibridazione per valutare la fase di rivelazione. La lettura del microarray avviene mediante lettore e software dedicati. I dati(inclusa la comparazione di diverse procedure di purificazione del DNA virale, sia manuali che automatizzate) sono stati confrontati con quelli ottenuti utilizzando una procedura di ibridazione in fase liquida (HC2 hybrid Capture; Digene, Gaithersburg, USA), sistema diagnostico che si basa sull’uso di sonde che ibridano la regione L1. Nella presente valutazione, sono stati testati 97 campioni clinici (tamponi cervicali), in parte provenienti da pazienti con accertata displasia o con diagnosi di ASCUS. Nell’iniziale valutazione di diversi metodi di purificazione di acidi nucleici, sono state raffrontate diverse tipologie di tampone e di procedure di purificazione di DNA, al fine di identificare la procedura pre-analitica più idonea alla nuova piattaforma molecolare. Questa fase dello studio ha consentito di definire le condizioni ottimali per l’automazione dell’estrazione di DNA, elemento essenziale per l’uso routinario del nuovo test. I risultati dei 2 saggi sono stati i seguenti: dei 97 campioni valutati, precedentemente testati con procedura di ibridazione in fase liquida per la regione L1, tutti i campioni positivi tranne 4 si sono riconfermati tali per la regione L1 in microarray ( i questi. 18 in infezione da singolo tipo e 3 con documentate infezioni multiple). Le positività per la regione E6/E7 sono state 14; in alcuni casi riguardanti campioni negativi per la regione L1. Tutti i negativi si sono confermati tali. Due campioni non hanno presentato il controllo per beta-globina umana e sono stati considerati pertanto potenziali falsi negativi e ritestati. In conclusione, il sistema basato sulla rilevazione su microarray di un prodotto di multiplexPCR , rappresenta una soluzione avanzata ed efficace per la ricerca di bersagli genici multipli. Nel nostro particolare studio, i risultati ottenuti dal raffronto dei due test hanno evidenziato la buona sensibilità del nuovo sistema diagnostico e sottolineato l’importanza della ricerca delle regioni E6/E7, in aggiunta alla regione L1. Tale ricerca permette infatti di ridurre sensibilmente la possibilità di falsi negativi. Inoltre la presenza nel sistema di specifici controlli che consentono la valutazione dell’intera procedura diagnostica (estrazione, amplificazione e rivelazione), consente all’operatore il monitoraggio tecnico di tutte le fasi della procedura per ciascun campione analizzato.
[1] Laboratorio di Microbiologia e Virologia, Diagnostica e Ricerca San Raffaele, Milano,
[2] Unità di Ricerca e Sviluppo, bcs Biotech S.p.A., Cagliari, Italia
[3] Università Vita-Salute San Raffaele, Milano